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2例不育男性异常染色体核型分析

编辑:娜姐 来源:未知 资料编号:773820130829
资料介绍
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Keywords 3
前言 3
1 试剂、仪器与方法 4
1.1试剂 4
1.2 仪器 4
1.3方法 4
1.3.1标本收集 4
1.3.2试剂配制 4
1.3.3细胞接种 4
1.3.4细胞收获 5
1.3.5滴片显带 5
1.3.7FISH分析 5
2结果 5
2.1病例1资料及染色体核型如下 6
2.1病例2资料及染色体核型如下 7
3讨论 8
3.1染色体异常新核型的家系传递分析 8
3.1.1遗传性平衡易位 9
3.1.2易位携带者在家族中遗传 9
3.1.3新发生的结构畸变 9
3.2染色体的平衡易位与男性不育症 9
4结论 9
参考文献 10
致谢 11







2例不育男性异常染色体核型分析

学生:胡雪娇          导师:任来峰  邓胜  
摘要:目的 探讨男性不育与染色体核型异常之间存在的关系,为男性不育的发生机制和诊断提供一定的理论和实践依据。方法 以本实验室接收的男性不育患者为研究对象,在无菌条件下,取患者外周血接种到RPMI 1640培养基中,在37℃下培养72 h,终止培养前60 min加入秋水仙素。常规收获中期分裂相细胞,制片,75℃烤片24 h,用胰酶消化做G显带处理并染色,显微镜下观察和分析染色体核型。对核型异常患者再经荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)进一步确诊染色体异常的位点。结果 经核型分析发现2例异常染色体核型,均为平衡易位;其中,患者一核型为46, X, t (Y; 21),患者二核型为46, X, t (Y; 15)。FISH分析进一步确定给核型异常。结论 染色体异常是男性不育的重要原因之一,检测核型可为男性不育的诊断提供一定的参考价值。
关键词:男性不育;染色体;核型分析;平衡易位

Analysis of 2 Cases of Abnormal Chromosome Karyotype
in sterile male

Student: Hu Xuejiao  Mentor: Ren Laifeng  Deng Sheng 

Abstract: Objective To investigate the relationship between male sterility and chromosome abnormality, and to provide a theoretical and practical basis for the occurrence and diagnosis of male infertility. Methods To receive the laboratory of male infertility patients as the research object, under sterile conditions, take patients outside week blood inoculation into RPMI 1640 culture medium, at 37℃cultured 72 h,terminated the culture of 60 min prior to the addition of colchicine.Conventional harvest metaphase cells, producer, 75℃ baking sheet for24 h , by trypsin digestion of G banding treatment and staining, microscope observation and karyotype analysis.In situ hybridization Fluorescence (FISH) was further confirmed by the chromosome abnormality in the chromosome abnormality. Results 2 cases of abnormal chromosome were found to balance translocation by karyotype analysis;Among them, the patients had a karyotype of 46, X, t (Y; 21), and the patients had two nuclear chromosome 46, X, t (Y; 15).FISH analysis further identified the karyotype abnormality.Conclusion Chromosome abnormality is one of the important causes of male sterility, and the detection of chromosome can provide a reference value for diagnosis of male infertility.
Keywords: male sterile; chromosome; karyotype analysis; Balanced translocation

前言
随着经济的发展,造成男子不育症的原因很多,而染色体异常是最重要且最常见的原因之一[1]。异常染色体的可能有两种来源,一种可能是遗传而来,另一种则可能为新发生的染色体畸变。由于染色体异常可以导致基因和(或)基因组数量和结构的改变,也可以破坏基因正常的表达,并且每1条染色体带所含基因数目不一样,受基因多态性的影响,当染色体一旦发生畸变就可能表现非特异性的多样性的临床表现,并累及多个器官系统的形态和功能,从而引起某些疾病的发生[2~4]。染色体异常的检测可采用常规的核型分析。
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)是采用荧光标记的DNA探针,利用探针与被检测样本中DNA碱基对的互补性,在探针与样本的DNA杂交后,通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果,从而检测细胞、组织样本中的染色体或基因异常,该方法具有灵敏、特异等优点,可确证核型分析结果。本研究对北京海思特临床检验所接收的男性不育患者进行核型分析,发现2例染色体异常核型,并经FISH确证。
1 试剂、仪器与方法
1.1试剂
外周血淋巴细胞培养基(湖南湘雅基因技术生物有限公司)、秋水仙素(Irvine Scientific)、胰蛋白酶(上海生工生物工程有限公司)、冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)、甲醇(广州新建精细化工厂)、CEP X Spectrum Orange/Y Spectrum Green Direct Labeled Fluorescent DNA Probe(Vysis公司)、细胞核染料DAPI(Vysis公司)。
1.2 仪器
OLYMPUS BX53 显微镜(日本 OLYMPUS公司),Metasystems Ikaros分析系统(德国 Zeiss公司),OLYMPUS BX51 荧光显微镜(日本 OLYMPUS公司),TermoBrite荧光原位杂交仪(Abbott公司),Applied Spectral Imaging (AIS)分析软件(以色列 实用光谱影像公司)。
1.3方法
1.3.1标本收集
在分拣平台核对好标本信息(如:姓名、年龄、性别、送检日期、标本来源、初复诊、标本类型、项目名称),正确写出各个标本应该接种的培养基类型。
1.3.2试剂配制
NaHco3(%10):5g NaHco3+50ml H2O
混合液:Na2HOP4 1.79g+500mlH2O   NaHPO4 0.78g +500mlH2O溶解后混匀
胰酶:0.25g胰酶+50ml生理盐水 
分装每1ml/EP管:每1ml胰酶溶于45ml生理盐水
生理盐水:4.5gNacl+500mlH2O
吉姆萨染液:甲基红 亚甲蓝
1.3.3细胞接种
接种时在保证自己的安全的前提下,一定要做到无菌操作。标本先消毒在插入注射器。抽取少量血液推片和计数。期间避免注射器的针头接触其它物质。计数时注意区分好白细胞和气泡等杂质(白细胞一般为在调节微调时会变色和反光,另外对不好看的计数板可以在计数前看看,以观察杂质的形态和特点。更好的区分出来)。裂解液配制:2ml冰醋酸+98ml H2O+2滴吉姆萨染液分装390ml/EP管,计数时每管冲入10ul血液标本。
在正确计数后,按400/计数 的计算方法计算出接种量。培养基瓶口现在酒精灯焰旁拷下在打开,并快速的将准确的血液标本接种到培养基内,拧好盖并写好编号(血量少的标本标记上“收一”)。整个过程都要在灯焰旁进行,一定要避免杂菌的污染。(接种过程中可能会碰到血液凝块,血液粘稠度大,不好抽取的现象,抽血时让注射器针头可以贴着比本血管内壁,比较容易抽。计数时遇到此类血液可以使移液枪倾斜一点,个人发现这样还是很有效果的)
1.3.4细胞收获
提前准备好低渗液和离心管(低渗液配制:2.8gKCL+500mlH2O),放入37度水浴锅预热。提前配制好秋碱,骨髓培养基在避光下加入80ul秋碱,外周血培养基避光加入40ul,再培养半小时后倒入提前准备好贴上标签的离心管内(注意收一的倒一瓶,尽量倒干净,培养基内不要有太多残余)。
低渗:离心后用真空泵吸取上清(注意不要吸走沉淀),每管加低渗液最少至8ml,及时放进水浴锅内。并用吸管吹打20下左右,低渗半小时(中间吹打5-10下)。
预固定:每管加入1ml固定液(低渗期间配制,并要求现配现用。配制方法:乙酸:甲醇=1:3),吹打均匀后离心。
第一次固定:离心后用真空泵吸取上清(注意不要吸走沉淀),每管加入8ml固定液,用吸管谁打均匀,静置半小时后离心。
第二次固定:离心后轻轻的在离心机内取出,不要震荡沉淀,慢慢的倒去上清(千万要注意底物,如果不慎把底物震荡起来就再次离心),加入8ml固定液,用吸管谁打均匀,静置10分钟左右后再次离心。
1.3.5滴片显带
轻轻从离心机内取出后,倒去上清时看看保留底物,倒去上清(注意操作要轻)。加入微量固定液震荡后,放入冰箱以备滴片。常规收获中期分裂相细胞,制片,75 ℃烤片24 h,用胰酶消化做G显带处理并染色。
1.3.6核型分析
结合Ikaros图像分析软件分析染色体核型,计数100 个分裂期染色体,分析30 个核型,核型异常者加倍计数和分析。
1.3.7FISH分析
常规收获中期分裂相细胞,制片,75 ℃烤片2 h,加入CEPX/CEPY探针,Termo Brite荧光原位杂交仪Melt Temp 72 ℃, 8 min;Hyb Tem 37 ℃, 16~20 h,分别用2×SSC/0.3% NP-40溶液和2×SSC/0.1% NP-40溶液洗脱两次,DAPI染液染色细胞核,结合(AIS)分析软件,分析中期分裂相50个。
2结果
  2.1病例1资料及染色体核型如下 
患者男性,25岁,少精症,夫妇身体健康,否认家族史。取外周血淋巴细胞培养,常规制备染色体,G显带处理,并用Zeiss分析系统进行拍照分析。常规计数100个中期分裂相,分析30个中期分裂相,根据国际人类染色体命名系统(ISCN2009)确定异常染色体核x型患者染色体核型为46, X, t (Y; 21) (Ypter→Yq12::21p12→21qter; Yqter→Yq12::21p12→21qter) (图1) ,患者妻子染色体核型正常。患者FISH为:nuc ish Xp11.1-q11.1 (CEPX×1), Yq12 (CEPY×1) [50] (图2),中期FISH结果证实t (Y; 21)(图3)。


图1 患者染色体分散图 (箭头示易位染色体)


图2 患者FISH图 (箭头示易位染色体)




图3 患者染色体核型图(箭头示易位染色体)

2.1病例2资料及染色体核型如下
患者男性,24岁,少精症,夫妇身体健康,否认家族史。遗传细胞学检查:取患者外周血淋巴细胞培养,常规制备染色体,G显带处理,并用Zeiss分析系统进行拍照分析。常规计数100个中期分裂相,分析30个中期分裂相,根据国际人类染色体命名系统(ISCN2009)确定异常染色体核型。核型为46, X, t (Y;15) (Ypter→Yq12::15q25→15qter;15pter→15q25::Yq12→Yqter)(图4),据做家系调查。患者FISH为:nuc ish Xp11.1-q11.1 (CEPX×1),Yq12 (CEPY×1) [50] (图5)

图4患者染色体核型图 (箭头示易位染色体)




图5患者FISH图 (箭头示易位染色体)

3讨论
3.1染色体异常新核型的家系传递分析
某些文献报道大多的先天性染色体结构异常大部分是平衡易位[5],平衡易位指由两条不同源的染色体各发生断裂后,互相变位重接而形成两条结构上重排的染色体称平衡易位。平衡易位原有基因总数不变,同时对个体发育和基因作用一般无严重影响。文献表明平衡易位携带者在家族中具有稳定遗传[6],家族中的携带者,对染色体有明确异常的患者,需进行产前诊断,从而避免遗传病的发生。遗传物质的不平衡严重影响胚胎的发育,可能造成流产、死胎及畸形儿。
3.1.1遗传性平衡易位
胎儿是从父母双方各获得一条染色体组成自己的染色体,如果他没有全部遗传父亲(母亲)易位的染色体,或是没有全部遗传父亲(母亲)正常的染色体,而是只遗传了一条易位的衍生染色体,这就会出现遗传物质总数不对的状况,从而造成某个易位节段的缺失(部分单体)或多余(部分三体),这样就破坏了遗传物质的平衡。
3.1.2易位携带者在家族中遗传
对家族中的平衡易位携带者,同时对染色体有明确异常者,需进行产前诊断,易避免遗传给下一代。而遗传物质的不平衡严重影响胚胎的发育,造成流产、死胎及畸形儿。平衡移位虽然会导致流产,但也有正常胎儿或平衡易位携带者出生。为了避免这些情况的发生,应做产前检查。
3.1.3新发生的结构畸变
父母核型正常,由于亲代的卵细胞或精细胞早期受到损伤,从而导致胎儿发育不正常[7]。
3.2染色体的平衡易位与男性不育症
从古到今男性不育症困扰着15%的家庭,而染色体异常又是常见的病因之一,7%不育症男性和10%~15%的无精症患者中可检测到染色体异常[8~9]。而平衡易位,有时会涉及Y染色体与常染色体的易位,这容易使位于Yqll上控制精子生成的融合的基因片段缺失、丢失或重组,从而影响患者的生精功能异常而导致不育[10]。本文2例异常染色体核型均为平衡易位,平衡易位携带者由于只是染色体片段的位置发生改变,并没有遗传物质的重复或丢失,因此携带者表型及智力发育正常[11]。理论上,在生殖细胞减数分裂时,平衡易位一般会形成18 种配子。1种核型正常及1种平衡易位携带者,其余16种皆为部分三体或部分单体,后者由于基因的剂量效应导致胚胎停育、流产、畸胎、新生儿死亡等情况,且染色体平衡易位携带者导致生育染色体异常的几率高达50%~100%[12]。
4结论
综上所述,染色体异常是导致男性不育的重要原因之一,因此,对不育男性,应常规进行染色体核型分析,对染色体异常的患者还应提供必要的遗传咨询,避免异常染色体传递给下一代。


参考文献
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[5] 王凤菊,张颖新,等. 10例世界首报异常染色体核型及临床研究[J]. 中国优生与遗传杂志,2008,16(5):1006~953
[6] 张爱萍,张学红,等. 128例异常染色体核型的细胞遗传学分析[J]. 中国优生优育,2009,15(1):30~32
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[11] 石张燕,张富,等. 常染色体非特异性精神发育迟滞相关基因研究进展[J]. 遗传,2010,32(2):135~140
[12] 付莉,毛熙光,等. 男性不育患者Y染色体无精子因子基因微缺失的研究[J]. 中华医学遗传学杂志,2015,32(1):85~88 
[13] 谭欣. 探究精子DNA损伤诊断男性不育的临床意义[J]. 临床医药文献电子杂志,2015,2 :297~298 













致谢
本论文设计在任来峰老师和邓胜老师的悉心指导和严格要求下进行,从课题选择、方案论证到具体设计和调试,无不凝聚着任老师的心血和汗水,在此向任老师表示深深的感谢和崇高的敬意。正是有了他们的悉心帮助和支持,才使我的毕业论文工作顺利完成,在此向我的母校--山西医科大学汾阳学院,医学检验系的全体老师表示由衷的谢意,感谢他们五年来的辛勤栽培。
大学生活即将匆匆忙忙地过去,但我却能无悔地说:“我曾经来过。”但它给我的影响却不能用时间来衡量,这五年以来,经历过的所有事,所有人,都将是我以后生活回味的一部分,是我为人处事的指南针。就要离开学校,走上工作的岗位了,这是我人生历程的又一个起点,在这里祝福大学里跟我风雨同舟的朋友们,一路走好,未来总会是绚烂缤纷。
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