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头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及其机制探讨

编辑:娜姐 来源:未知 资料编号:773820130829
资料介绍
目录

摘要和关键词 3
前言 3
1 材料与方法 4
1.1 实验材料 4
1.1.1 菌株 4
1.1.2 主要试剂 4
1.1.3 主要仪器 4
1.2 实验方法 4
1.2.1 菌液培养 4
1.2.2 头孢他啶最低抑菌浓度( MIC)测定 4
1.2.3 抑制生物膜形成实验 4
1.2.4 清除生物膜实验 5
1.2.5 生物膜形成相关基因相对表达量检测 5
2 结果 6
2.1 抗生素实验浓度的确定 6
2.2 抑制生物膜形成实验 6
2.2 清除生物膜实验 8
3 讨论 9
致  谢 11








头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及其机制探讨

——天津市高等学校科技发展基金计划项目(No: 20060620)
通讯作者:魏殿军weidianjun@gmail.com 天津市河西区平江道22号 300211

【摘要】目的 探讨头孢他啶在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)生物膜形成过程中的抑制、清除作用及其作用机制。方法(1)通过 96 孔板结晶紫染色方法,定量分析头孢他啶对 PA 生物膜的抑制、清除作用。(2)通过 real time-PCR 方法对生物膜形成相关基因的表达进行相对定量分析,来探讨头孢他啶对 PA 生物膜的作用机制。 结果 (1)未形成成熟生物膜时,头孢他啶对 PA 生长的抑制效果较好,而在有成熟生物膜形成时,头孢他啶不能有效抑制 PA 的生长。(2)头孢他啶与 PA 生物膜形成相关基因的增多表达相关。 结论 头孢他啶能够促进 PA 生物膜形成相关基因的表达,临床上对于慢性 PA 感染患者的治疗应当避免使用头孢他啶。
【关键词】铜绿假单胞菌;生物膜;头孢他啶
Effects and the Mechanism of Ceftazidime in the Formation of Pseudomonas aeruginosa Biofilms

[Abstract] Objective To explore the process of suppression of ceftazidime in Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa, PA) biofilm formation, scavenging and its mechanism. Method (1) By 96 crystal violet staining method, quantitative analysis of ceftazidime PA biofilm inhibition and scavenging. (2) By real time-PCR method for the formation of biofilm related gene expression relative quantitative analysis, to explore ceftazidime PA biofilm mechanism. Results (1) do not form mature biofilms, ceftazidime PA growth inhibition better, and in a mature biofilm formation, ceftazidime can inhibit the growth of the PA. (2) PA ceftazidime and increased biofilm formation associated genes expression. Conclusion PA ceftazidime can promote biofilm formation associated gene expression, the clinical treatment of patients with chronic PA infection should avoid ceftazidime.
[Key words] Pseudomonas aeruginosa; bioflim; ceftazidime

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是慢性呼吸道感染的常见条件致病菌,是位居第四位的医院获得性感染致病菌,与大约 10% 的医院获得性感染相关。积极有效的抗生素治疗能够改善 PA 感染患者的肺功能,提高患者生存质量。然而因其极易产生生物膜,导致对抗菌药物的耐药性也显著增加 [1,2 ]。现代微生物学观点认为生物膜是 PA感染的主要存在形式 [ 3 ]。因此,研究抗生素对于生物膜形成的相关作用,具有重要的临床价值。头孢他啶是传统的PA治疗抗生素,但其在慢性PA感染患者的治疗效果有限。本文在先前研究 PA 生物膜形成相关基因及调控的基础上[4,5],探讨头孢他啶对 PA 生物膜的抑制、清除作用及其作用机制以及对临床治疗相关疾病的指导意义
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株 非黏液型 PA 标准菌株 PAO1 由美国德克萨斯 A&M 大学 ThomasK.Wood 教授惠赠;天津医科大学第二医院检验科保存菌株。
1.1.2 主要试剂 结晶紫染料、无水乙醇、0.9% 生理盐水、高压后去离子水、LB 肉汤。本实验所用抗生素头孢他啶的标准品从天津医科大学第二医院感染研究所获得。
1.1.3 主要仪器 酶标仪 SUNRISE (瑞士)、实验所用 real time-PCR 扩增仪为 BIOER Real-time PCR Detection System。
1.2 实验方法
1.2.1 菌液培养 取 PAOl 菌落接种到 5 ml  LB 肉汤中,37 ℃ 恒温培养箱培养 8 h 至对数生长期。比浊法调整菌液浊度,使菌液浓度约为 1.5 × 108 CFU/ml(相当于 0.5 麦氏管浊度)。
1.2.2 头孢他啶最低抑菌浓度( MIC)测定  用微量稀释法测定头孢他啶对 PAOl 的 MIC,并据此配置浓度分别为 1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC 的含有头孢他啶的 LB 肉汤备用。
1.2.3 抑制生物膜形成实验 将 10 μL 上述浓度菌液加入到 96 孔板中,并分别加入 200 μL 含有浓度为 1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC 的头孢他啶 LB 肉汤,空白对照孔只含 LB 肉汤,实验对照孔含有上述菌液和 LB 肉汤,每种浓度及对照实验均做三个复孔(如表1);37 ℃ 静止培养 24 h 后,将培养液倒掉并用高压去离子水冲洗各孔,只留下各孔形成的生物膜。取出 96 孔板用结晶紫染色方法,利用酶标仪测定各孔样品在 570 nm 光波的吸收值,间接观察抗生素对生物膜抑制作用的强弱。研究生物膜形成相关基因相对表达量时,用含 1/2 MIC 浓度的头孢他啶 LB 肉汤重复上述过程,刮取孔底及孔壁的生物膜,放入 1.5 ml 离心管中备用。
表1  抑制生物膜形成实验
实验组1
1MIC+LB 实验组2
1/2MIC+LB 实验组3
1/4MIC+LB 空白对照(只加LB) 实验对照(只加LB)
菌液 + + + - +
副孔1 + + + - +
副孔2 + + + - +
副孔3 + + + - +

1.2.4 清除生物膜实验 将 10 μL 上述浓度菌液加入到 96 孔板中,并分别加入 200 μL  LB 肉汤,空白对照孔只含 LB 肉汤。然后 37 ℃ 静止培养 24 h 后,把培养液倒掉并用高压去离子水冲洗各孔,只留下各孔形成的生物膜。空白对照孔和实验对照孔加入200μL LB 肉汤,其余各孔分别加入 200μL 含有浓度为 1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC 的头孢他啶 LB 肉汤,每种浓度及对照实验均做三个复孔。37 ℃ 静止培养 24 h 后把培养液倒掉并用高压去离子水冲洗各孔,只留下各孔形成的生物膜(如表2-1,表2-2)。取出 96 孔板用结晶紫染色方法,利用酶标仪测定各孔样品在 570 nm 光波的吸收值,间接观察抗生素对生物膜抑制作用的强弱。研究生物膜形成相关基因相对表达量时,用含 1/2 MIC 浓度的头孢他啶 LB 肉汤重复上述过程,刮取孔底及孔壁的生物膜,放入 1.5 ml 离心管中备用。
表2-1  清除生物膜实验
实验组1
LB    实验组2
LB 实验组3
LB 空白对照
LB 实验对照
LB
菌液 + + + - +
副孔1 + + + - +
副孔2 + + + - +
副孔3 + + + - +

表2-2  清除生物膜实验
实验组1
实验组2
实验组3
空白对照 实验对照
1MIC +   
1/2MIC  +  
1/4MIC   + 


1.2.5 生物膜形成相关基因相对表达量检测  使用 Biomega 公司产品试剂盒提取上述实验所收集的生物膜细菌的总 RNA,逆转录成 cDNA,然后使用大连宝生物工程有限公司产品 PrimeScrip SYBR green kit(D441)进行实时荧光定量 PCR 检测,引物见表1。反应体系(20μL):10μL 2×SYBR premix Ex TaqTM,上下游引物各 1μL,cDNA 工作液 1.5μL,无酶水 6.5μL。反应过程:95℃ 10s,1个循环; 95℃ 5s,60℃ 20 s,40个循环。每份样本复孔测定,实验过程均设对照。

表3  PA 生物膜形成相关基因 PCR 引物序列

基因 引物序列(5→3’) 扩增片段长度(bp)
proC(管家基因) 正义: CAGGCCGGGCAGTTGCTGTC
反义: GGTCAGGCGCGAGGCTGTCT 180
algD 正义: CGAGAAGTCCGAACGCCACAC
反义: ATCGGCGGGAAGTCGTA 186
pslA 正义: GGCCTGTTTCCCTACCT
反义: GCGGATGTCGTGGTTG 207
pelA 正义: GGCCTGCTCGAATACCTC
反义: TGACCTTGAGTTTCTGCGACA 265
LasI 正义: ACAAATTGGTCGGCGCGAAGAG
反义: GCATGTAGGGGCCAGTGGTATC 230
LasR 正义: GAAGATGGCGAGCGACCTTGGATTC
反义: CTCGTGCTGCTTTCGCGTCTGGTAG 229
RhlA 正义: CGCCTGAAAGCCAGCAACCATC
反义: GTGCCCTCCACCCGCGAGAAAC 242
2 结果
2.1 抗生素实验浓度的确定 通过微量稀释法确定头孢他啶的 MIC 为 4 μg/ml,因此实验用头孢他啶浓度 1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC 对应为4、2、1 μg/ml。
2.2 抑制生物膜形成实验 已有文献报道生物膜酶标仪测定值大于 0.5 可以认为有生物膜形成[6]。微孔板结晶紫染色法实验结果表明,不同浓度的头孢他啶均能抑制生物膜的形成,与实验对照组相比,结果均具有统计学意义(P < 0.05);不同浓度的头孢他啶抑制生物膜形成能力略有不同,但差别无统计学意义。结果见图1。Real time-PCR 结果表明,药物浓度为 1/2 MIC 的头孢他啶实验组与不添加头孢他啶的实验对照组相比,其生物膜相关基因的表达量有数倍乃至数十倍的增加,结果具有统计学意义( P<0.05 )。结果见图2。

图1 三种浓度的头孢他啶抑制 PA 生物膜形成实验结果。实验对照组为未添加头孢他啶的 PA 生长对照组。
图2 1/2MIC 浓度头孢他啶抑制 PA 生物膜形成实验的生物膜形成相关基因表达量。实验对照组为未添加头孢他啶的 PA 生长对照组。
2.2 清除生物膜实验 微孔板结晶紫染色法实验结果表明,与对照组相比,三种浓度的头孢他啶均不能有效清除已经形成的生物膜,并且 PA 生物膜形成能力反而更强,差异具有统计学意义( P<0.05 ),结果见图3。Real time-PCR 结果表明,药物浓度为 1/2 MIC 的头孢他啶实验组与不添加头孢他啶的实验对照组相比,头孢他啶依然能够促进生物膜形成相关基因的表达,结果具有统计学意义( P<0.05 )。结果见图4。

图3  三种浓度头孢他啶对 PA 生物膜清除实验结果。实验对照为无抗生素生物膜生长2天对照组。

图4 1/2MIC 浓度头孢他啶对 PA 生物膜清除实验的生物膜形成相关基因表达量。实验对照为无抗生素生物膜生长2天对照组。
3 讨论
微孔板结晶紫染色法可用于高通量分析临床菌株的生物膜形成能力。该方法简便、准确、高效,对于辅助指导临床合理使用抗生素具有重要意义。Real time-PCR 以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究的重要工具。结合使用上述两种研究方法可以同时观察宏观改变及基因表达水平的微观变化,能够更加完整的评价抗生素对生物膜的影响,使得结果更加真实、准确。
微孔板结晶紫染色法结果表明,不同浓度的头孢他啶均能抑制 PA 生物膜的形成,而均不能有效清除已经形成的 PA 生物膜。此实验结果与国外研究组报道结果相似[7]。作者认为,稳定成熟的 PA 生物膜中 β-内酰胺酶的增多表达有助于浮游细菌对头孢他啶的耐药性。本研究组先前研究已经证明了密度感知系统 lasI、lasR,鼠李糖脂转移酶合成相关基因 rhlA 及多糖合成相关基因 algD、pelA、pslA 与生物膜的形成密切相关[4,5]。因此本研究组通过 real time-PCR 来分析头孢他啶对生物膜形成相关基因表达量的影响。结果表明,不管是未形成生物膜时(抑制生物膜形成实验)还是已经形成生物膜时(清除生物膜实验),头孢他啶均与生物膜形成相关基因的增多表达相关。
本文首次从生物膜形成相关基因表达量变化的角度来探讨头孢他啶对于慢性 PA 感染患者临床治疗效果较差的原因。综合本文及国外研究结果,我们认为,头孢他啶在治疗慢性 PA 感染患者时,非但不能提高治疗效果,反而可能通过 β-内酰胺酶及生物膜形成相关基因的增多表达而使细菌增殖,加重感染。这两种机制可能通过协同作用,共同降低了头孢他啶的临床治疗效果。对于尚未形成成熟生物膜的早期急性感染,头孢他啶虽能促进生物膜形成相关基因的表达,但因生物膜尚未成熟,不能有效抵御头孢他啶对细菌的杀灭作用,加之 β-内酰胺酶的表达量尚未升高,不能有效水解抗生素,因此可能具有良好的治疗效果;然而,对于慢性感染患者,其体内存在稳定成熟的生物膜,能够有效抵御最初暴露于抗生素的风险,并通过激活β-内酰胺酶相关基因[7]及生物膜形成相关基因的表达,进而使β-内酰胺酶数量增多、生物膜增厚,最终水解大量的头孢他啶,使之不能有效作用于生物膜内部的细菌,降低临床治疗效果。基于上述研究结果,临床上对于慢性 PA 感染患者的治疗应当避免使用头孢他啶。

参考文献
[1] Høiby N. Prospects for the prevention and control of pseudomonal infection in children with cystic fibrosis [J]. Paediatr Drugs,2000,2 (6) :451-463.
[2] 王瑾,闫亮,王昆,等.急诊重症监护病房患者下呼吸道感染铜绿假单胞菌的研究[J]. 中华医院感染学杂志,2006,16 (11) :1305-1306.
[3] O'Toole GA, Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis[J].Mol Microbiol,1998, 28 ( 3) :449-461.
[4] 李琬琛,魏殿军,李立艳, 等. 铜绿假单胞菌 lasI/lasR 群体感应系统与生物膜形成相关基因表达调控的研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2012, 22: 3685-3687
[5] 李立艳,魏殿军. 铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2009, 29(6)
[6] 江娟, 翟涤.医源性表皮葡萄球菌ica操纵子转录水平对生物膜表型的影响[J] .上海医学, 2006, 29( 1) , 40.
[7]  Laura L, Bowler, et al. Mature Pseudomonas aeruginosa Biofilms Prevail Compared to Young Biofilms in the Presence of Ceftazidime[J]. Antimicrob Agents and Chemother. 2012,56(9): 4976-4979.

  



致  谢
在本人论文写作的每一个过程中,都有许多老师给予了大力的帮助和指导,在此深表感谢!同时也感谢所有其他帮助和指导过我的同学和朋友。
首先,也是最主要感谢的是我的指导老师,李婉琛老师和游荷花老师。在整个过程中他给了我很大的帮助。在论文选题时,他根据我实际实习情况为我推荐了一些合适题目,让我结合自身的特点进行选题。在写作过程中,老师给我指导思想,让我有了明确的写作思路。在完成初稿后,老师认真查看了我的文章,与我进行交流,指出论文中的不足,并且帮助我改进。在此十分感谢刘春建老师的悉心指导,才能让我顺利完成毕业论文。
其次,我要感谢大学期间每一个教过我的老师,是你们的倾囊相授,才不至于让我在完成毕业设计的时候捉襟见肘,你们交给我的知识才是我完成篇论文的基础。
此外,我还要感帮助过我的每一位同学。不论是查阅文献,还是检查格式,都离不开他们的鼎力相助。有了他们才能使我更快更好地完成论文。在此,向他们表示衷心的感谢。
最后,我要感谢论文写作过程中每一位帮助过我的人,是你们的不惜余力的帮助,才能使我很快,很好的完成本毕业论文设计。
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