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结肠癌中丝/苏氨酸磷酸化位点对CacyBP/SIP核转位的影响

编辑:娜姐 来源:未知 资料编号:773820130829
资料介绍
摘  要

目的:结肠癌发生机制目前还未明确,因此缺乏理想的治疗手段。钙周期素结合蛋白 (Calcyclin-binding protein,CacyBP/SIP),是1998年发现的以Ca2+依赖的方式作为S100蛋白家族的靶蛋白。结构分析提示:CacyBP/SIP具有核定位信号;具有潜在的PKC磷酸化位点。功能研究表明:在结肠癌中,具有依赖Ca2+浓度的核转位及磷酸化现象,并促进癌细胞增殖。本实验通过构建CacyBP/SIP的丝/苏氨酸磷酸化位点的显性负性突变体,明确丝/苏氨酸磷酸化位点对CacyBP/SIP在结肠癌细胞内定位的影响,以图揭示CacyBP/SIP核转位的分子机制,进而抑制CacyBP/SIP核转位的关键环节,以期从源头上抑制结肠癌细胞增殖,为在分子水平上治疗结肠癌提供实验依据。
方法:首先,通过基因克隆及基因重组等基因工程方法构建pEGFP-N1-hCacyBP真核表达质粒。其次,通过磷酸化激酶数据库网站预测hCacyBP蛋白潜在的丝/苏氨酸磷酸化位点,以pEGFP-N1-hCacyBP真核表达质粒为模板,采用PCR介导的定向突变方法,构建hCacyBP蛋白的丝/苏氨酸显性负性突变体。然后,将pEGFP-N1空载,pEGFP-N1-hCacyBP对照组质粒及其丝/苏氨酸磷酸化突变质粒分别通过脂质体介导方法瞬时转染入结肠癌SW480细胞中。最后,通过免疫荧光和激光共聚焦方法,观察hCacyBP及其丝/苏氨酸显性负性突变体在结肠癌细胞内的定位表达。
结果:1.成功构建了pEGFP-N1-hCacyBP真核表达质粒。2.通过磷酸化激酶数据库网站具体预测并筛选了9个hCacyBP蛋白的潜在丝/苏氨酸磷酸化位点。3.以pEGFP-N1-hCacyBP真核表达质粒为模板,进一步成功构建了hCacyBP蛋白的9个丝/苏氨酸磷酸化显性负性突变体,分别为S3A,S34A,S48A,S137A,S141A,S142A,S180A,S188A,S217A。 4.将pEGFP-N1 空载,pEGFP-N1-hCacyBP对照组,及S3A,S34A,S48A,S137A,S141A,S142A,S180A,S188A,S217A这9组突变体分别转染入SW480细胞内,发现:pEGFP-N1定位于细胞核;pEGFP-N1-hCacyBP对照组hCacyBP蛋白在细胞浆中表达;S180A突变体在SW480细胞中绿色荧光分布于细胞核,并与蓝色荧光重合,说明hCacyBP蛋白的第180位丝氨酸突变失活后,hCacyBP蛋白能进入细胞核,出现核转位现象,因此,hCacyB的180位丝氨酸磷酸化对其核转位没有影响;S3A,S137A,S141A,S217A这4组突变体,绿色荧光很弱,分布于细胞膜上;S34A,S48A,S142A,S188A这4组突变体,绿色荧光较弱,只在细胞浆中表达,未与蓝色荧光重合,说明这4个丝氨酸磷酸化位点有可能会影响结肠癌中hCacyBP的核转位。
结论: hCacyBP的第180位丝氨酸磷酸化位点不是引起结肠癌细胞中hCacyBP核转位的磷酸化位点。第3位、34位、48位、137位、141位、142位、188位、217位丝氨酸磷酸化位点可能是引起hCacyBP核转位的重要靶点。
 
关键词 :钙周期素结合蛋白,核转位, pEGFP-N1载体,丝/苏氨酸磷酸化,突变体;

目  录

前  言 1
第一部分 pEGFP-N1/hCacyBP真核表达质粒的构建及鉴定 2
材料与方法 2
结  果 14
讨  论 15
附  图 16
第二部分  pEGFP-N1 –hCacyBP丝/苏氨酸磷酸化显性负性突变体的构建与鉴定 20
材料与方法 20
结  果 25
讨  论 26
附  图 28
第三部分  结肠癌中丝/苏氨酸磷酸化对CacyBP核转位的影响 37
材料与方法 37
结  果 43
讨  论 44
附  图 47
结  论 51
参考文献 52
综述 54
综述参考文献 54
致  谢 55
攻读学位期间发表的学术论文 57

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