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结肠癌SW480细胞中S100A1、S100A6对CacyBP/SIP核转位的影响

编辑:娜姐 来源:未知 资料编号:773820130829
资料介绍
   摘  要
钙周期素结合蛋白(calcylin binding protein,CacyBP)是Filipek 等首先从艾氏腹水瘤细胞中发现的一种约30kDa 的蛋白质,其可以和钙周期素(calcyclin或 S100A6) 结合,故此得名;之后在研究P53诱导的β-catenin泛素化降解新通路时,发现一种可以与sina的同源基因Siah-1(seven in absentia homolog 1)结合的蛋白,被命名为 SIP(Siah-1interacting protein),经序列分析,SIP和鼠CacyBP93%相同,因此,认为SIP即为人CacyBP。目前就把钙周期素结合蛋白命名为CacyBP/SIP。
CacyBP/SIP是S100家族的靶蛋白之一,可以和S100A1、S100A6、S100A12、S100B及S100P结合。同时,S100蛋白又是以EF-手形(EF-hand)结构为特点的钙结合蛋白家族成员之一,当其和Ca2+结合后,构象发生改变,结合相应的靶蛋白,发挥自身特异的生物学效应。此外,研究显示,神经元细胞未受刺激时,Ca2+浓度为50nM,CacyBP/SIP位于细胞质中;用KCI处理细胞后使Ca2+浓度升至300nM,CacyBP/SIP环状定位于核周,即神经元细胞中Ca2+浓度的变化可以诱导CacyBP/SIP的核转位,那么Ca2+是否通过与S100结合,激活S100活性,并通过S100与CacyBP/SIP结合,使CacyBP/SIP作为第三信使进入细胞核传递信号,本课题将对此进行探讨。
目的 
1. 结肠癌SW480细胞中Ca2+浓度变化对CacyBP/SIP核转位的影响。2. 结肠癌SW480细胞中,核转位前后S100A1、S100A6与CacyBP/SIP的结合情况及结合量的变化情况;抑制相应S100蛋白表达,观察其对CacyBP/SIP核转位的影响。
方法 
1.给予不同浓度Ca2+载体ionomycin(0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)刺激结肠癌SW480细胞,通过间接免疫荧光,激光共聚焦观察CacyBP/SIP在细胞内的定位变化,并动态扫描细胞内荧光强度的变化,记录细胞内游离Ca2+浓度的相对水平。2.给予Ca2+载体ionomycin(5μmol/L)和不同浓度Ca2+拮抗剂BAPTA/AM(0μM、5μM、10μM、25μM)共同刺激结肠癌SW480细胞,通过间接免疫荧光,激光共聚焦观察Ca2+浓度降低后CacyBP/SIP在细胞内的定位变化,并动态扫描细胞内荧光强度的变化,记录细胞内游离Ca2+浓度的相对水平。3.采用MTT法检测细胞的活力及用Annexin V/PI法检测细胞凋亡的情况,排除由于细胞内Ca2+超载对本实验的影响。
4.升高Ca2+浓度,采用免疫共沉淀法检测核转位前后S100A1、S100A6与CacyBP/SIP的结合情况及结合量的变化情况。5.设计针对S100A6的三组siRNA,通过Real-Time PCR和Western blot方法筛选出一组沉默效果最好的siRNA,转染结肠癌SW480细胞,免疫荧光检测抑制S100A6表达对CacyBP/SIP核转位的影响。
结果 
1.CacyBP/SIP主要位于细胞质中(未给刺激时),在给予ionomycin刺激后CacyBP/SIP发生核转位,并于5μmol/L刺激时核转位现象最为明显(CacyBP/SIP主要位于细胞核中),随ionomycin浓度(10μmol/L)进一步升高, CacyBP/SIP又重新分布于细胞质和细胞核;同时用ionomycin处理细胞后细胞内游离Ca2+浓度逐渐增高,且于5μmol/L ionomycin刺激时最高,之后随ionomycin浓度升高Ca2+浓度趋于平稳(P =0.000)。这一结果说明当细胞内Ca2+浓度升高后CacyBP/SIP转位至细胞核,且随着Ca2+浓度的进一步升高,CacyBP/SIP又重新分布于细胞质和细胞核。
2.随BAPTA/AM刺激浓度的升高发生核转位的CacyBP/SIP又重新聚集细胞质;同时细胞内游离Ca2+浓度随BAPTA/AM刺激浓度的升高逐渐降低(P =0.000)。这一结果说明细胞内Ca2+浓度的降低可以使发生核转位的CacyBP/SIP返回细胞质。
3. MTT法检测显示处理组SW480细胞的细胞存活率与未处理组无显著差异(P =0.985);Annexin V/PI法检测也未发现明显的早期凋亡的情况(P=0.168)。这一结果说明细胞内Ca2+超载对本实验结果没有影响,实验结果准确可靠。
4.发生核转位前后S100A1、S100A6都与CacyBP/SIP结合,但结合量及其变化明显不同;S100A1与CacyBP/SIP的结合量少,且核转位前后结合量之间的差异无统计学意义(P>0.05),这提示S100A1可能对CacyBP/SIP核转位没有影响或影响很小;但是在发生核转位后S100A6与CacyBP/SIP的结合量较转位前明显增加(P<0.05),且明显高于转位后S100A1的结合量(P<0.05),这提示S100A6可能在CacyBP/SIP的核转位中发挥了重要作用。
5.通过Real-Time PCR和Western blot方法检测发现siRNA-S100A6-2组沉默效果最好,抑制率分别为87.9%和85.0%,故选用siRNA-S100A6-2干预SW480细胞,使S100A6蛋白表达受到抑制,再给予5μmol/L ionomycin刺激时,核转位受到明显抑制,CacyBP/SIP定位于细胞质和细胞核,并未完全转位至细胞核中,这进一步说明S100A6在CacyBP/SIP的核转位中发挥了重要作用。
结论 
1. 在结肠癌SW480细胞中,当细胞内Ca2+浓度升高后CacyBP/SIP转位至细胞核,随着Ca2+浓度的进一步升高,其又重新分布于细胞质和细胞核,且Ca2+浓度降低亦可使发生核转位的CacyBP/SIP返回细胞质,即在结肠癌SW480细胞中,随着细胞内Ca2+浓度的变化,CacyBP/SIP发生了进出核的转位。
2.在结肠癌SW480细胞中,核转位前后S100A1、S100A6都和CacyBP/SIP结合,但前者结合量少且核转位前后结合量没有变化,这提示S100A1可能对Ca2+介导的CacyBP/SIP核转位没有影响或影响很小;S100A6在核转位后结合量明显增多,且抑制S100A6表达后,CacyBP/SIP核转位受到明显抑制,这提示结肠癌SW480细胞中Ca2+介导的S100A6与CacyBP/SIP的结合在CacyBP/SIP核转位中发挥了重要作用。

关键字  结肠癌,CacyBP/SIP,核转位,S100蛋白
目录


第一部分结肠癌SW480细胞中Ca2+浓度变化对CacyBP/SIP核转位的影响
前言 1
材料和方法 2
结果 7
讨论 15
参考文献 18
第二部分结肠癌SW480细胞中S100A1、S100A6对CacyBP/SIP核转位的影响
前言 20
材料和方法 22
结果 33
讨论 41
参考文献 44
结论 46
综述CacyBP/SIP 研究进展 47
综述参考文献 56
致谢 61
攻读学位期间发表的学术论文 62

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