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结肠癌细胞中 CacyBP/SIP 入核后下游靶蛋白的筛选

编辑:娜姐 来源:未知 资料编号:773820130829
资料介绍
摘 要

目的:结肠癌(colorectal cancer, CRC)发病率呈逐年上升的趋势,但目前对结肠癌的发病机制仍不清楚。钙周期素结合蛋白( Calcyclin-binding protein ,
CacyBP/SIP)主要表达于细胞质中,本课题组前期研究发现,胃泌素可刺激结肠癌细胞
SW480 中 CacyBP/SIP 发生核转位,且促进细胞增殖。本研究为进一步筛选 CacyBP/SIP入核后下游相互作用的靶蛋白,探索 CacyBP/SIP 入核后下游结合分子的信号通路,探究其在结肠癌发生发展中的可能作用。
方法:采用胃泌素刺激人结肠癌 SW480 细胞胞质中的 CacyBP/SIP 进入细胞核,构建
CacyBP/SIP 核转位细胞模型,用激光共聚焦扫描显微镜术和蛋白免疫印迹(Western
Blot)验证细胞模型成功建立。培养未给予胃泌素刺激的结肠癌 SW480 细胞为未刺激组,提取造模组与未刺激组核蛋白,采用 iTRAQ 技术结合 LC-MS/MS,筛选两组差异蛋白,行
Mascot 数据库检索,Go 在线对差异蛋白进行功能注释聚类分析,并运用 KEGG 对蛋白富集的信号通路进行分析。
结果:1.胃泌素刺激人结肠癌 SW480 细胞中 CacyBP/SIP 入核,构造 CacyBP/SIP 入核功能的细胞模型,蛋白免疫印迹验证 CacyBP/SIP 入核功能的细胞模型成功建立。2.激光共聚焦扫描显微镜术验证 CacyBP/SIP 入核功能的细胞模型成功建立。3. iTRAQ 技术筛选出差异蛋白 2136 个,其中表达上调的有 173 个,表达下调的有 132 个。4.生物信息学分析表明,生物学过程的差异表达蛋白主要集中在生物合成过程(biosynthetic
process)、细胞过程(cellular process),分子功能分类中,差异表达蛋白主要富集于结合功能( binding )、催化功能(catalyti cactivity)。细胞成分(cellular
component)的蛋白主要集中于 organelle 上。 筛选具有结合功能、定位于细胞核且差



异倍数大于 1.5 的蛋白,共 7 个,分别为 PML、VDAC2、AnnexinA1、UBE2、Filamin-A, Heat shock protein beta-1、Cathepsin B。Pathway 代谢通路注释筛选出 67 条通路,其中具有显著性的通路共 6 条,4 条通路有关键蛋白表达,分别是:Calcium signaling pathway、 Ubiquitin mediated proteolysis、VEGF signaling pathway、MAPK signaling pathway.


结论:iTRAQ 筛选出 CacyBP/SIP 入核后的差异蛋白 2136 个,173 个上调,132 个下调。差异蛋白主要集中在生物合成及细胞过程,主要定位于 organelle,以结合功能为主; KEGG 通路分析筛选出 67 条信号通路, P ≤ 0.05 的通路共 6 条; 有意义蛋 UBE2,VDAC2,AnnexinA1,Filamin-A,HSPB1 表达上调,PML 表达下调,且表达于 4 条有意义通路。



关键词:结肠癌,钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP),胃泌素,iTRAQ 技术

目录



前言 1
第一部分 CacyBP/SIP 入核功能的细胞模型的制备及验证 3
材料与方法 3
结果 8
讨论 10
第二部分基于 iTRAQ 的 CacyBP/SIP 入核前后差异蛋白的筛选及生物信息学分析 11
材料与方法 12
结果 84
讨论 87
结论 88
参考文献 93
综述 97
致谢 101
攻读学位期间发表的论文 102

前言
结肠癌(colorectal cancer,CRC)具有高发病率、高死亡率的特点,严重威胁人类健康[1]。因此了解结肠癌的发生发展过程,明确其发病机制,有利于寻找结肠癌中的生物标记物以及治疗靶蛋白,对其早期诊断、有效治疗具有重要的临床应用意义。
结肠癌的发生发展与其他肿瘤一样是一个复杂的过程,仅用传统的单因素分析无法准确的反映其复杂的发病机制,因此对于肿瘤的研究逐渐趋向于高通量、多基因的研究模式[2、3]。因蛋白质组学可从分子水平上,直观动态的进行定量研究,明确肿瘤发生发展过程中的蛋白质的变化情况,是研究肿瘤发生机制的重要手段,相关技术正在蓬勃发展。常用的蛋白质组学技术有双向电泳[4](two-dimensional electrophoresis,2-DE)、质谱技术(mass spectrometry,MS)[5]、同位素亲和标签(isotope coded-affinity tags,
ICAT) 技术[6] 等。同位素标记相对和绝对定量(isobaric  tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ )技术[7]是由美国 Darryl Pappin 博士团队发明的一种基于串联质谱方法的蛋白质定量技术,是一种新的、功能强大的蛋白质定量技术,与传统技术相比,具有通量高、重复性好、定量准确、鉴定结果可靠、操作简单、蛋白检测范围广等优点,因此已成为蛋白组学,尤其是肿瘤研究领域中寻找差异蛋白的有效的手段,已经被广泛应用于多种肿瘤如肺癌[8]、卵巢癌[9]、乳腺癌[10]、前列腺癌[11]、胃癌[12]等的血清标记物的筛选、多药耐药等研究中。
钙周期素结合蛋白[13]( Calcylin Binding Protein, CacyBP/SIP)是一种分子量大小约为 30KD 的以钙依赖的方式结合 S100 家族的蛋白。 CacyBP/SIP 最早在艾氏腹水瘤细胞中被发现,后发现其还存在于大鼠、小鼠以及人的其它细胞和组织中。
研究已表明,CacyBP/SIP 可与 TBL1、微管蛋白、Siah-1、Skp1、ERK1/2 等多种靶蛋白相互作用,并可参与泛素化途径、细胞骨架构建、细胞周期及肿瘤的发生发展[14]。在结肠癌及神经母细胞瘤中,主要表达于细胞质中的 CacyBP/SIP 可以随 Ca2+浓度的变化而发生出入核的现象[15]。蛋白在细胞中的表达与定位和其生物学功能相关,已有研究证实 CacyBP/SIP 的入核与肿瘤密切相关[16]。



本小组前期研究发现:CacyBP/SIP 在正常结肠组织中无表达,而高表达于结肠癌组织中,且在细胞核中高表达[17]。CacyBP/SIP 具有依赖 Ga2+浓度的核转位现象,该现象在结肠癌中也存在[17]。在结肠癌细胞中,胃泌素[17]、表皮生长因子[18]、KCL[19]、前列腺素 E2 [20]及缺氧均可刺激 CacyBP/SIP 入核,入核后可通过缩短细胞周期 G1 期,增强 P27kip1的泛素化降解过程来促进结肠癌细胞增殖[21]。前期,我们在基因水平进行了研究,利用泛素化芯片和细胞周期芯片筛选了 CacyBP/SIP 入核前后的差异表达基因,得到众多表达上调和下调的基因[22],我们对部分基因进行验证,与基因芯片结果一致,表明基因芯片结果可靠。那么在蛋白水平上,CacyBP/SIP 入核前后是否有相似的差异表达?这些差异表达蛋白有何特点及功能?哪些蛋白质分子与 CacyBP/SIP 入核之后的功能有关,进而参与了结肠癌的发生发展?因此,本课题展开进一步研究。


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