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结肠癌中CacyBP/SIP核转位后相关信号通路差异表达基因的筛选及验

编辑:娜姐 来源:未知 资料编号:773820130829
资料介绍
摘  要
目的:结肠癌发病率呈逐年上升的趋势,但目前对结肠癌的发病机制仍不清楚。钙周期素结合蛋白(Calcyclin-binding protein, CacyBP/SIP)主要表达于细胞质中。本课题组前期研究发现,胃泌素刺激结肠癌细胞观察到CacyBP/SIP具有核转位现象,且促进结肠癌细胞增殖。本研究以期进一步筛选CacyBP/SIP核转位后下游相关信号通路差表达基因并验证 ,探究其在结肠癌发生发展中的可能作用,为探索CacyBP/SIP入核后下游结合分子的信号通路提供研究方向。
方法:选用慢病毒包装的含目的基因CBP-SBP-CacyBP-3X Nuclear targeting sequences病毒上清液感染的SW480结肠癌细胞;采用细胞周期PCR芯片和泛素化途径信号通路PCR芯片筛选出差异表达基因;采用胃泌素刺激CacyBP/SIP进入细胞核,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)验证五个差异表达倍数大于2的基因进行核酸和蛋白表达水平。
结果:1.蛋白免疫印迹验证慢病毒包装含目的基因CacyBP/SIP由CBP标签带核定位信号的质粒转染后的SW480细胞胞核中CacyBP/SIP蛋白稳定高表达。2.细胞周期和泛素化途径信号通路PCR芯片共168个基因。其中细胞周期PCR芯片有84个基因,其中有72个分子个表达上调,12个分子表达下调。泛素(泛素化)PCR芯片共84个基因,其中有66个分子表达上调,18个分子表达下调。差异表达倍数大于2的基因有5个:CASP3, BRCA2, CKS2, CDK8表达上调,PARK2表达下调。3.10-7mol/L胃泌素刺激SW480细胞48h成功制备了CacyBP/SIP入核的细胞模型。4.qRT-PCR验证5个差异基因其差异CASP3, BRCA2, CKS2,和CDK8表达上调,差异表达倍数为:BRCA2为1.92,CDK8为2.38;CKS2为2.25;CASP3为1.82,PARK2 表达下调差异表达倍数为0.133。统计学分析,BRCA2无统计学意义,其余四个均有统计学差异。CacyBP/SIP入核后胞核中CDK8,,CKS2,CASP3,BRCA2蛋白水平表达上调,蛋白PARK2表达下调。
结论:CacyBP/SIP入核后通过对细胞周期和泛素化途径的调控促进结肠癌细胞增殖;CacyBP/SIP入核后通过对CDK8, CKS2, PARK2调节促进结肠癌细胞增殖。

关键词:钙周期素结合蛋白,核转位,基因芯片,差异表达基因,胃泌素
目录
前言 ………………………………………………………………………………………  1
第一部分 CacyBP/SIP入核后下游相关信号通路的差异表达基因的筛选…………… 3
材料与方法 …………………………………………………………………………………3
结果 …………………………………………………………………………………………11
讨论 …………………………………………………………………………………………25
第二部分 CacyBP/SIP入核后从mRNA和蛋白水平验证筛选的差异表达基因…………27材料与方法 …………………………………………………………………………………27
结果 …………………………………………………………………………………………32
讨论 …………………………………………………………………………………………39
结论 …………………………………………………………………………………………41
参考文献 ……………………………………………………………………………………42
综述 …………………………………………………………………………………………46
致谢 …………………………………………………………………………………………54
攻读学位期间发表的论文………………………………………………………………… 55

前言
结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,随着人们生活水平的提高,生活方式及饮食结构的改变,结肠癌的发病率呈逐年上升趋势,且患者逐渐趋向年轻化。 目前关于结肠癌的发生,发展机制尚不明确,对结肠癌的治疗也缺乏有效手段。
随着对钙周期素结合蛋白( Calcylin Binding Protein, CacyBP/SIP)研究深入,发现CacyBP/SIP的生物学功能主要为参与细胞骨架构建,细胞分化,构成泛素连接酶复合体介导新的β-catenin降解、参与肿瘤细胞的发生发展等。通过对CacyBP/SIP结构分析发现其可以与Siah-1,Skp1,Tubulin ,ERK1/2和S100蛋白家族中的S100A6, S100A1, S100A12,S100B,S100P相互作用。在神经母细胞瘤内不同Ca2+浓度下,钙周期素结合蛋白(Calcyclin binding protein,CacyBP/SIP)可发生核转位和磷酸化现象。蛋白表达定位发生改变常伴有生物学功能的改变,CacyBP/SIP核转位可能作为信号分子传递信息从而参与相应生物学功能。
本小组前期研究发现:CacyBP/SIP在结肠癌组织中高表达,在正常结肠组织中无表达,这提示CacyBP/SIP与结肠癌的发生发展密切相关。在结肠癌细胞中,胃泌素,KCL,表皮生长因子,前列腺素E2可刺激CacyBP/SIP入核,缺氧也可以使CacyBP/SIP入核。且在入核后可促进结肠癌细胞的增殖。这提示CacyBP/SIP在核转位后可能作为上游肿瘤信号分子发生信号传递到下游。CacyBP/SIP入核后缩短细胞周期G1期,另外,CacyBP/SIP参与泛素化信号途径,我们推测CacyBP/SIP在入核后可能通过对细胞周期和泛素化途径来促进细胞增殖。那么,CacyBP/SIP入核后是否是通过细胞周期和泛素化途径中促进结肠癌细胞增殖?其具体调控分子为何?因此,本课题展开进一步研究。
本课题组前期已成功构建了用慢病毒包被的CacyBP/SIP带有核定位信号的真核表达质粒,且慢病毒表达载体成功感染SW480细胞。在此基础上,本研究拟通过构建CacyBP/SIP在细胞核内高表达模型,选用细胞周期PCR芯片和泛素化途径相关信号通路PCR芯片筛选CacyBP/SIP 表达差异基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)从核酸和蛋白水平验证CacyBP/SIP入核后的差异表达基因。以期为结肠癌中CacyBP/SIP入核后的差异表达基因进行筛选及验证,为探索CacyBP/SIP入核后下游结合分子的信号通路提供研究方向,为CacyBP/SIP在细胞周期和泛素化信号通路中发挥作用的机制研究提供依据,从而进一步揭示CacyBP/SIP入核后促进结肠癌细胞增殖的原因。



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